中科院發明基因功能鑒定新方法，致死突變基因也能快速分析

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中科院發明基因功能鑒定新方法，致死突變基因也能快速分析

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2021-03-09 15:12 | 稿件來源：香港新聞網

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　　香港新聞網3月9日電據“腦科學與智能技術卓越創新中心”微信公號消息，2021年2月8日，《Development》期刊在線發表了中科院腦科學與智能技術卓越創新中心(神經科學研究所)、上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室劉志勇研究組題為《嵌合CRISPR-stop技術實現核心基因突變的快速表型分析》的研究論文。

本文圖均為腦科學與智能技術卓越創新中心微信公眾號圖

　　小鼠和人類的聽覺系統在發育和功能上十分相似，因此，利用小鼠模型篩查耳蝸聽覺毛細胞發育過程中的重要基因對於毛細胞再生和臨床上尋找耳聾基因的治療靶點有重要的意義。雖然目前耳蝸毛細胞在幼年和成年不同發育時期的轉錄組分析已有報道，但是至今為止，我們對於毛細胞分化成熟的分子機制還知之甚少。其中一個主要的原因是因為傳統的小鼠模型構建費時費力，通常需要首先構建F0代小鼠，然後進行生殖細胞傳代，獲得遺傳穩定的F1小鼠之後再進行後續的實驗。

　　為了快速進行突變基因的表型篩查，劉志勇研究組於2018年建立了直接在F0代小鼠中同時敲除三個非致死基因的方法。但是，小鼠約25%的基因純合突變會導致早期胚胎流產或者出生後致死，導致之前的策略並不適用致死基因的突變篩查。解決這個問題的常規策略是利用Cre/Loxp系統進行條件性基因突變，但是更加費時費力。

　　如何加速致死基因的表型分析呢？本研究首次嘗試在小鼠2細胞期卵裂球的1個細胞內注射單堿基編輯元件和基因特異性的sgRNA，產生嵌合體突變的小鼠，即在該小鼠各個器官內，野生型(沒有基因編輯的細胞後代)和純合突變型(經過基因編輯的細胞後代)的細胞交錯分布，這種方法因此被命名為MosaicCRISPR-stop。

　　該研究首先利用Atoh1基因來檢測方法的可行性。Atoh1 -/- 小鼠不能產生耳蝸毛細胞且出生後由於呼吸節律紊亂而致死。結果顯示，利用Mosaic CRISPR-stop方法產生的Atoh1突變小鼠的耳蝸毛細胞數量顯著減少且該小鼠可以存活到成年。

圖1: 利用Atoh1驗證嵌合型突變方法的可靠性。(A)雙報告基因小鼠的模式圖。沒有cre表達時，所有細胞表達紅色蛋白。反之，有cre表達時，細胞關閉紅色，開始表達綠色蛋白。(B)二細胞期受精卵的一個細胞注射cre, 內生細胞團(inner cell mass，ICM)和耳蝸(cochlea)同時含有綠色和紅色的細胞。(C)Atoh1基因兩個高效的sgRNA(1+3)的位置示意圖。(D)在二細胞期受精卵的一個細胞內注射cre，單堿基編輯系統 (BE3) 和 2個針對Atoh1基因的sgRNA(1+3)，直接產生的F0小鼠是嵌合型純合突變，可以用於快速的表型分析。(E-F) 相對於對照組(E)，嵌合型純合突變小鼠耳蝸的毛細胞數量顯著減少。

　　隨後，致死基因Sox10突變耳蝸長度縮短的表型也可以被Mosaic CRISPR-stop方法重現。

　　最後，該研究利用此方法探索了Rbm24基因(其突變導致心臟異常和胚胎期死亡)的功能。Rbm24在耳蝸毛細胞高峰度表達，但其功能還完全未知。

　　利用Mosaic CRISPR-stop方法，作者在8周內快速鑒定出了Rbm24 -/-嵌合小鼠耳蝸的表型為毛細胞大量死亡，這表明Rbm24對於毛細胞的存活發揮了重要的功能。這個表型也可以被傳統的Rbm24條件性敲除小鼠模型所重復。

圖2: 利用嵌合型突變方法快速鑒定出Rbm24是維持耳蝸外毛細胞存活的重要基因之一。(A)二細胞期受精卵的其中一個細胞注射更新版本的單堿基編輯系統(hA3A-BE3) 和 Rbm24特異的sgRNA-1，直接產生的嵌合型純合突變F0小鼠可以立即用於表型分析。(B-C’) 相對於對照組 (B 和B‘)，嵌合型純合突變耳蝸(C和C’) 的外毛細胞大量死亡。白色箭頭所示是殘留的、依然表達Rbm24的外毛細胞 (Prestin+)。(D) 跟注射LacZ sgRNA (藍色)的對照組相比，實驗組(紅色)的外毛細胞數量顯著降低。

　　值得強調的是：Mosaic CRISPR-stop研究方法不僅適用於聽覺系統，也適用於其他器官組織，具有很高的普適性，可以大大加速發育神經生物學領域鑒定基因功能的速度。

　　該工作由中科院腦智卓越中心聽覺系統發育再生研究組劉志勇研究員指導，主要由博士研究生王廣琴與博士後李超共同完成，研究組的賀順姬也做出了重要貢獻。該研究中的共聚焦成像相關工作在中科院腦智卓越中心所級中心的光學成像平台完成，楊輝研究組提供了顯微注射儀器，動物房劉倩在胚胎移植實驗中提供了很大幫助。本工作得到中科院、科技部、基金委的基金資助。

　　(原標題：一種新型快速鑒定重要基因功能的遺傳學方法)

【編輯：mahua】